Identification and Functional Analysis of 3-Phosphatidylinositol Kinase FAB1/PIKfyve Gene Family in Rice (Oryza sativa)

Xu Yichun　Liang Wanqi　Wang Canhua　Yu Jing ^*

School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai, 200240

*Corresponding author, jingleyj@163.com

Abstract　FAB1/PIKfyve is a key enzyme that catalyzes phosphatidylinositol 3-phosphate (PtdIns3P) to form phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate (PtdIns (3,5) P₂). Its product PtdIns (3,5) P₂ plays an important role in the development of eukaryotic cells. In order to figure out the function of PtdIns (3,5) P₂ in rice reproductive development, this study combined bioinformatics and genetics methods to identify the rice FAB1/PIKfyve genes, analyzed the physical and chemical properties, gene structures, conserved domains, phylogenetic tree, cis-acting elements, tissue expression profiles and used CRISPR/Cas9 gene editing technology to obtain osfab1b mutants. Bioinformatics analysis results showed that nine FAB1 gene family members were identified from the whole genome of Oryza Sativa. Gene structure analysis indicated the differences existed in the gene structure of FAB1 family, the number of exons are 8-12. Conserve domain analysis showed that OsFAB1A and OsFAB1B contained the N-terminal FYVE domain, and the remaining members contained the Cpn60_TCP1 domain and PIPKc kinase domain. Phylogenetic analysis indicated that the functions of FAB1 family were highly conserved in mono- and dicotyledonous plants. Prediction of cis-element in the upstream regulatory region of FAB1 genes revealed a variety of growth-related, light-responsive, and hormone and stress-responsive cis-elements. Tissue expression profiles showed that most of FAB1 genes were global-expressed, and the high expression of FAB1C sub-cluster genes in lemma and palea suggested that they might be involved in floral organ development. Finally, the osfab1b mutants were obtained through the CRISPR/Cas9 system, and the pollen vitality of the osfab1b mutants showed no significantly abnormality, implied that FAB1 family had functional redundancy in the reproductive development of rice. The present results provide a theoretical reference for biological function studies of the phosphatidylinositol regulatory network in rice.

Keywords　Rice (Oryza sativa), FAB1 / PIKfyve gene family, Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, CRISPR/Cas9

磷脂酰肌醇(PIs)是生物膜甘油磷脂的成分之一，其D-肌醇环的3、4和5位羟基可发生多重磷酸化反应形成多样的衍生物，共同构成复杂的磷脂酰肌醇代谢网络(Balla, 2013)。其中，3,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns (3,5) P₂)是真核细胞内含量最低的磷脂酰肌醇衍生物，与之相反PtdIns (3,5) P₂在内膜运输、信号转导、细胞极性生长以及细胞骨架重组等多个细胞发育过程中具有关键调控功能(Michell et al., 2006; Takasuga and Sasaki, 2013)。FAB1 (Formation of aploid and binucleate cells 1)/PIKfyve (FYVE finger-containing phosphoinositide kinase)激酶催化PtdIns3P是PtdIns (3,5) P₂合成的唯一途径(Takasuga and Sasaki, 2013)。酵母Fab1p、人类PIKfyve和小鼠P235等典型的FAB1/PIKfyve激酶均包含三个保守结构域，分别是N端FYVE (FAB1p, YOTB, Vac1p, EEA1)结构域，中间的Cpn60_TCP1伴侣蛋白样结构域以及C端的PIPKc激酶结构域，此外动物PIKfyve还含有一个DEP结构域(Michell et al., 2006; Botelho et al., 2008; Takasuga and Sasaki, 2013)。生化研究表明FYVE结构域可特异性地结合PtdIns3P，并且这种结合作用对于FAB1激酶的内膜定位至关重要(Gaullier et al., 1998)，Cpn60_TCP1结构域与肌动蛋白和微管蛋白的有效折叠相关(Botelho et al., 2008)，PIPKc激酶结构域为催化PtdIns3P形成PtdIns(3,5)P₂的关键结构域。不同于酵母和人类中的Fab1p/PIKfyve为单拷贝基因，拟南芥基因组中有四个编码FAB1激酶的基因FAB1A-D，其中只有FAB1A/B呈经典的Fab1p/PIKfyve同源蛋白结构，FAB1C/D缺少N端的FYVE结构域，同时FAB1A-D均未发现具有DEP结构域(Mueller-Roeber and Pical, 2002; Whitley et al., 2009)。

PtdIns(3,5)P₂水平的平衡对于真核细胞的正常发育至关重要。酵母和动物均中有研究表明，Fab1p/PIKfyve功能缺陷影响液泡、内体及溶酶体形态以及渗透调节、液泡pH调控等过程，并且与内膜稳态的维持密切相关(Gary et al., 1998; Ikonomov et al., 2001)。Whitley等(2009)发现模式植物拟南芥中FAB1A/B单基因的功能缺失仅造成叶片轻微卷曲，然而fab1a/fab1b双突变体花粉在第一次有丝分裂后液泡不能正常裂解且致死。雌二醇诱导下的条件性fab1a/fab1b双突变体表现出多效性发育异常，如植株矮化、根伸长受阻、根向重力性失调和对外源生长素处理不敏感等，同时过表达FAB1A/B植株显示相似的发育缺陷并伴有花器官形态异常，暗示FAB1家族功能存在冗余性和剂量效应(Hirano et al., 2011)。抑制PtdIns(3,5)P₂的合成或在fab1b/fab1c T-DNA突变体中都可观察到脱落酸诱导下的气孔关闭延迟，并且在fab1b/fab1c双突变体中的气孔关闭速度低于单突变体，验证了FAB1家族功能的冗余性(Bak et al., 2013)。此外，PtdIns (3,5)P₂参与调控花粉管的极性生长，fab1b和fab1d突变体中花粉管膜运输受到干扰并且伴随活性氧的产生减少(Serrazina et al., 2014)。上述研究均表明这些发育缺陷与内膜运输过程影响的液泡酸化有关，但目前FAB1激酶的直接下游作用因子尚不明确，部分研究表明其可通过结合V-PPase (Vacuolar proton pyrophosphatase)影响液泡膜上的质子转运过程(Bak et al., 2013)。

植物磷脂酰肌醇代谢调控网络随着近年来的研究已逐步建立起来，但其分子作用机制及功能研究是亟待完善的，特别是在单子叶模式植物水稻中的研究较少。因此，在本研究中通过生物信息学方法鉴定到9个水稻FAB1基因家族成员，对其理化性质、基因结构、保守结构域、系统进化关系及组织表达模式进行分析，并且利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得osfab1b突变体，为研究FAB1家族及其产物PtdIns(3,5)P₂在水稻生殖发育中的生物学功能提供理论基础及遗传材料。

1结果与分析

1.1水稻FAB1家族基因鉴定

拟南芥基因组中已知编码FAB1蛋白的基因共有4个，分别是FAB1A (At4g33240)、FAB1B (At3g14270)、FAB1C (At1g71010)、FAB1D (At1g342260) (Mueller-Roeber and Pical, 2002)。以这4个基因的全长蛋白序列为目的序列在NCBI和Phytozome v12.1数据库中进行Blastp比对，初步获得候选基因。然后，利用CD-search工具筛选同时具有Cpn60_TCP1和C端PIPKc激酶结构域的基因，共鉴定到9个水稻FAB1基因家族成员(表1)。根据这些基因和拟南芥FAB1A-D基因的同源性对其进行命名，便于后续的描述。这些基因的核酸长度在5 600～14 836 bp间，CDS长度范围为4 146～5 496 bp，最长的蛋白产物含有1 831个氨基酸残基，最短的蛋白产物含有1 381个氨基酸残基。通过ProtParam工具对蛋白的理化性质进行分析，其中分子量最大的蛋白是OsFAB1A (LOC_Os03g28140)，为203.39 kD，分子量最小的蛋白是OsFAB1D-3 (LOC_Os04g59540)，为155.72 kD，等电点范围在5.21～6.5间。

表 1 水稻FAB1家族成员信息及特性 Table 1 Information of FAB1 family members identified in japonica rice and characteristics

1.2水稻FAB1基因结构及染色体分布分析

除OsFAB1D-1具有两个转录本外，水稻FAB1基因家族成员均只有一个转录本，对其基因结构进行分析(图1)，结果显示OsFAB1A和OsFAB1B具有高度相似的外显子和内含子排布模式，其余基因的结构存在一定的差异，外显子数量为8-12个，内含子数量为7~11个。此外，OsFAB1D-1具有超过4 kb的上下游非编码区，OsFAB1C-1和OsFAB1C-3缺少5’端非编码区，OsFAB1A和OsFAB1D-2不具有非编码区。

图 1 水稻FAB1的基因结构 Figure 1 Gene structure of FAB1 in rice

通过MG2C软件对该家族基因的染色体位置分布进行分析(图2)，发现这9个基因分布于水稻6条染色体上。其中在8号染色体上分布最多，分别是OsFAB1B、OsFAB1C-2和OsFAB1D-4，9号染色体上有2个基因的分布，OsFAB1A、OsFAB1D-3、OsFAB1C-1和OsFAB1D-1分别分布于3号、4号、6号和12号染色体上。

图 2 水稻FAB1基因在染色体上的位置分布 Figure 2 The chromosome location of FAB1 genes in rice

1.3水稻FAB1蛋白保守结构域分析

传统的Fab1p及其同源蛋白结构由N端FYVE结构域，中间的Cpn60_TCP1伴侣蛋白样结构域以及C端的PIPKc激酶结构域组成。前人研究表明拟南芥中仅FAB1A和FAB1B具有N端的FYVE结构域，FAB1C和FAB1D为不含FYVE结构域的截短形式(Mueller-Roeber and Pical, 2002; Whitley et al., 2009)。通过CD-search工具对水稻FAB1蛋白的保守结构域进行预测，结果显示仅有OsFAB1A和OsFAB1B包含N端FYVE结构域，其余成员只含有Cpn60_TCP1和PIPKc激酶结构域(图3A)，与拟南芥中的研究结果一致。值得注意的是，水稻中无FYVE结构域的FAB1蛋白截短形式(7个)明显多于拟南芥(2个)，表明在单子叶植物进化过程中FAB1蛋白结构更加多样，可能具有不同于双子叶植物FAB1蛋白的新功能。PIPKc激酶结构域由约260个氨基酸组成，通过DNAMAN软件对水稻及拟南芥的PIPKc激酶结构域进行蛋白序列比对，结果显示同源性达到74.51%(图3B)，提示其激酶功能在水稻和拟南芥中的高度保守性。

图 3 水稻FAB1蛋白的保守结构域分析 注: A: 水稻FAB1蛋白保守结构域; B: PIPKc激酶结构域的氨基酸序列比对 Figure 3 Analysis of conserved domains of FAB1 proteins in rice Note: A: Conserved domain of FAB1 proteins; B: Amino acid sequence alignment of PIPKc kinase domain

1.4植物FAB1家族系统进化分析

为了进一步研究FAB1家族在单子叶植物和双子叶植物中的系统进化关系，利用水稻(9个)、大麦(8个)、高粱(8个)、拟南芥(4个)、大豆(7个)、毛果杨(6个)的FAB1蛋白序列构建系统进化树(图4)。结果显示，FAB1家族可分为3个亚类，水稻FAB1A和FAB1B与其它植物FAB1A/B基因聚为第I类，3个水稻FAB1C基因与其它植物FAB1C基因聚为第II类，4个水稻FAB1D基因与其它植物FAB1D基因聚为第III类。在每个亚类中均有单子叶和双子叶植物FAB1成员的分布，表明这3个亚类的功能分化早于单、双子叶植物的分化。并且单、双子叶植物FAB1基因在各亚类中聚为不同的进化支，推测其功能在单、双子叶植物中已经发生分化。

图 4 单, 双子叶植物FAB1家族的系统进化分析 Figure 4 Phylogenetic analysis of FAB1 family in mono- and dicotyledonous plants

1.5水稻FAB1基因家族启动子顺式元件分析

为研究水稻FAB1基因家族在应答生物胁迫、非生物胁迫及激素信号中可能存在的机制，对其起始密码子上游2kb调控区域的顺式作用元件进行预测(表2)。结果显示，水稻FAB1基因的启动子区域富含多种光响应元件(Sp1, Box4, G-box等20种)、激素响应元件和胁迫响应元件。其中激素响应元件包括TGA-element生长素响应元件、ABRE脱落酸响应元件，P-box赤霉素响应元件，TCA-element水杨酸响应元件，TGACG/ CGTCA -motif茉莉酸甲酯响应元件；胁迫响应元件包括LTR低温响应元件，参与干旱诱导的MYB结合位点MBS以及参与厌氧诱导ARE元件等。此外，启动子中还包含5种组织特异型顺式元件(CAT-box, motif I, GCN4_motif, HD-Zip1, RY-element)。以上结果表明FAB1基因家族可能参与多个水稻生长发育过程，并且在多种激素响应和抵抗非生物协迫中具有功能。

表 2 水稻FAB1基因家族启动子区的顺式作用元件 Table2 Cis-elements in the promoters of FAB1 gene family

1.6水稻FAB1家族组织表达分析

对水稻FAB1家族基因的时空表达模式进行研究，为进一步了解其参与的生物学过程提供线索。利用芯片数据进行组织表达模式的分析(图5)，结果显示大部分水稻FAB1基因在各个组织中均有表达。OsFAB1A、OsFAB1C-2、OsFAB1C-3在叶片中显著表达，OsFAB1C-1、OsFAB1D-4主要在根中表达，OsFAB1D-2主要在茎中表达，但是FAB1基因在花药中的表达相对较低。此外，OsFAB1C-1、OsFAB1C-2在内外稃中表达较高，表明FAB1C亚类基因可能在花器官发育过程中具有功能。OsFAB1D-3在胚中显著表达，并且除OsFAB1D-3和OsFAB1D-4外，其余成员在胚乳中几乎不表达，表明OsFAB1D亚类基因可能参与调控种子发育过程。

图 5 水稻FAB1基因在不同组织中的表达模式 Figure 5 FAB1 gene expression profiles in different tissues

1.7 osfab1b突变体的获得及花粉育性评价

为验证水稻FAB1家族是否在水稻生殖发育过程中具有功能，利用CRISPR/cas9系统构建武运粳7号(9522)背景下的OsFAB1B敲除株系。靶点的选择要求基于Xie等(2015)的描述，分别于靠近5’端起始密码子及Cpn60_TCP1保守结构域上设计两个靶点。对获得的转基因苗进行基因型鉴定，结果显示得到2种突变类型的osfab1b突变体(图6)。osfab1b-1和osfab1b-2为双等位突变体，其中osfab1b-1在+162位置缺失一碱基T，另一等位+162位置连续缺失3 bp；osfab1b-2在+162位置缺失一碱基T，另一等位+163位置缺失2 bp，+168位置缺失一碱基G。上述突变类型均造成翻译在靶点2前终止或发生移码，故未对靶点2的突变类型进行分析。并且导致Cpn60_TCP1及PIPKc结构域的缺失，进而导致基因功能的完全丧失，为后续水稻FAB1家族的功能研究提供重要的遗传材料。

图 6 osfab1b CRISPR靶点及突变类型分析 Figure 6 osfab1b CRISPR targets and mutation type analysis

对T₀代CRISPR转基因植株进行花粉育性评价，碘染结果显示osfab1b-1和osfab1b-2突变体的花粉活力与野生型相比均无明显差异，表明水稻FAB1家族在花粉发育过程中可能存在功能冗余，单一基因的敲除无法导致生殖发育缺陷(图7)。

图 7 osfab1b突变体花粉活力检测 注: A: 野生型; B: osfab1b-1; C; osfab1b-2; 比例尺=100 μm Figure 7 Pollen vitality analysis of osfab1b Note: A: WT; B: osfab1b-1; C: osfab1b-2; Bars=100 μm

2讨论

PtdIns (3,5)P₂作为一类存在极微量的磷脂酰肌醇衍生物，其在真核细胞发育过程中具有的重要调控功能值得关注。FAB1/PIKfyve激酶通过募集效应蛋白至液泡膜共同维持细胞内PtdIns (3,5)P₂水平，并且参与调控多样的细胞发育过程(Balla, 2013)。然而单子叶模式植物水稻中PtdIns (3,5)P₂的功能及FAB1激酶的作用机制尚待阐明。本研究从水稻基因组中鉴定出9个FAB1家族成员，其核酸长度、分子量、等电点等理化性质均存在一定差异。同时，OsFAB1A和OsFAB1B具有相似的基因结构，其余成员的外显子内含子排布模式差异较大。通过保守结构域分析发现，除OsFAB1A和OsFAB1B与传统FAB1/PIKfyve家族蛋白相似具有N端FYVE结构域外，其余成员仅具有Cpn60_TCP1和PIPKc激酶结构域，这与Mueller-Roeber和Pical (2002)对拟南芥FAB1蛋白的描述一致。此外，水稻中无FYVE结构域的FAB1蛋白截短形式数量明显多于双子叶植物拟南芥，表明在单子叶植物进化过程中FAB1蛋白形式更加多样化。

为进一步研究FAB1家族在单子叶和双子叶植物中的进化关系，本研究构建了包含水稻、大麦、高粱、拟南芥、大豆、毛果杨6个物种中FAB1家族基因的系统进化树。结果显示FAB1家族基因分别聚为FAB1A/B、FAB1C和FAB1D三个亚类，每个亚类中均有单子叶和双子叶植物成员分布，提示FAB1家族功能的保守性并且功能分化早于单、双子叶植物的分化。前人研究表明在进化上无FYVE结构域的FAB1蛋白截短形式为植物中特有(Whitley et al., 2009)。尽管FYVE结构域对于FAB1激酶识别并靶向结合其底物PtdIns3P至关重要，酵母中研究表明FYVE结构域并非PtdIns (3,5)P₂合成所必需的(Botelho et al., 2008)，因此推测这种截短形式可能参与不同于传统FAB1激酶的植物发育过程。

越来越多的证据表明PtdIns (3,5)P₂可作为响应激素和胁迫的信号分子。当酵母细胞处于高渗休克时，PtdIns (3,5) P₂水平即时升高20倍(Duex et al., 2006)。在盐胁迫条件下，烟草花粉管细胞体积减小，同时伴随着PtdIns (3,5)P₂水平平均升高两倍(Zonia and Munnik, 2004)。PtdIns (3,5) P₂水平失调还影响脱落酸诱导的气孔关闭，暗示其在干旱胁迫中具有功能(Bak et al., 2013)。本研究对水稻FAB1家族基因的上游调控区域进行分析发现具有多种光响应元件、生长发育相关元件以及激素和胁迫响应顺式元件。值得注意的是，全部水稻FAB1家族基因的启动子区域都包含脱落酸响应元件ABRE，推测水稻中也存在类似响应脱落酸的气孔关闭调控机制。

动态的液泡变化是水稻花粉发育过程中的一个重要特征。使用抑制剂(YM201636)降低PtdIns (3,5)P₂水平会导致晚期内体和液泡形态维持异常(Hirano et al., 2017)。拟南芥fab1a/fab1b和vac14等PtdIns (3,5)P₂代谢途径相关突变体中均发现花粉在第一次有丝分裂后液泡无法正常裂解，导致花粉败育。这种花粉败育被认为与PtdIns (3,5)P₂水平降低导致的液泡膜表面极性运输及液泡酸化缺陷有关(Whitley et al., 2009; Zhang et al., 2018)。本研究中利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得osfab1b突变体，发现与野生型相比osfab1b突变体的花粉活力无明显缺陷。依据拟南芥中的研究，FAB1A/ B在花粉发育中存在功能冗余(Whitley et al., 2009)，并且条件性同时敲除FAB1A和FAB1B时才会引发多种单突变体中未观察到的营养生长缺陷(Hirano et al., 2011)。由此推测单子叶植物中FAB1A/B的功能存在冗余，需构建多突变体用于后续研究以明确FAB1家族在水稻生殖发育中是否具有功能。

3材料与方法

3.1植物材料

野生型水稻(Oryza sativa)为武运粳7号(9522)品种，2019年5月~10月种植于上海交通大学转基因试验基地。

3.2主要试剂

KOD FX高保真聚合酶购于东洋纺(上海)生物科技有限公司，Taq master mix购于南京诺唯赞生物科技有限公司，FokI和BsaI限制性内切酶购于NEB公司，T7连接酶购于宝日医生物技术(北京)有限公司；大肠杆菌感受态DH5α为本实验室自制，农杆菌感受态EHA105购于天根生物技术(北京)有限公司。载体pRGEB32和pGTR由Xie等(2015)提供。DNA测序服务由上海派森诺基因公司提供。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司提供。

3.3水稻FAB1家族成员鉴定

在拟南芥TAIR (https://www.arabidopsis.org/)数据库获取FAB1A-D全长蛋白序列作为query序列，分别于NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、Phytozome v12.1 (https://phytozome.jgi.doe.gov/)等公共数据库中进行Blastp比对，获得水稻候选基因。在Rice Genome Annotation Project (RGAP)数据库(http://rice. plantbiology.msu.edu/)中下载水稻候选基因的蛋白序列，并通过CD-search (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)对保守结构域进行预测(陈旭等, 2017)，确保候选基因中的蛋白序列同时具有Cpn60_TCP1及PIPKc激酶结构域。蛋白质分子量(kD)及等电点(pI)等理化性质使用ProtParam网站(https://web.expasy.org/protparam/)预测。

3.4水稻FAB1家族的生物信息学分析

在RGAP数据库获取水稻FAB1基因的全长基因组序列和CDS序列，使用GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)工具绘制基因结构示意图。在RGAP数据库获取基因在染色体上的位置分布及水稻染色体长度等数据，使用MG2C
 (http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)绘制染色体分布图。使用CD-search获取水稻FAB1蛋白保守结构域位置后通过iTOL (https://itol.embl.de/)在线工具绘图。拟南芥和水稻FAB1蛋白多序列比对使用DNAMAN软件完成。从Phytozome v12.1数据库获取高粱、大麦、大豆、毛果杨的FAB1同源蛋白序列，使用MEGA7.0邻接法(参数设置为Possion model, Bootstrap 1000)完成系统进化树的构建，并使用EvolView (https://www.evolgenius.info/evolview/)在线工具进行编辑和注释。在RGAP数据库获取水稻FAB1基因ATG上游2 kb序列，使用Plantcare (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/)预测顺式作用元件。

3.5水稻FAB1家族的表达分析

水稻FAB1基因在不同组织中的表达数据来自Rice X pro (https://ricexpro.dna.affrc.go.jp/)数据库，使用TBtools软件(Chen et al., 2020)完成热图的绘制。

3.6 osfab1b突变体的获得和基因型鉴定

在CRISPR-P 2.0(http:// crsripr.hzau.cn/CRISPR2)网站输入OsFAB1B的基因序列，寻找合适的靶标。分别于靠近5’端起始密码子ATG及Cpn60_TCP1保守结构域附近选择脱靶概率较低的两个靶点。靶点序列为PAM (Protospacer adjacent motif)序列及上游20个碱基(何先畅等, 2017)。根据Xie等(2015)中描述的方法，在靶点序列两端分别加上接头。构建完成CRISPR/Cas9质粒后，进行农杆菌转化及野生型水稻愈伤组织的侵染。提取转基因植株DNA作为模版，对靶点DNA片段进行PCR扩增并测序，测序结果通过在线工具DSDecodeM (http://dsdecode.scgene.com/home/)进行解码分析，完成基因型的鉴定。靶点及鉴定引物序列(表3)。

表 3 CRISPR构建及鉴定引物 Table 3 CRISPR construction and genotyping primers

3.7 osfab1b突变体的花粉育性评价

将野生型和突变体的花药分别置于I₂-KI溶液(0.2%碘和2%碘化钾)中，使用医用镊子将其夹碎使花粉均匀释放，在显微镜(Leica DM2500)下拍摄图片用于花粉育性的评价。

作者贡献

徐忆纯是本研究的实验设计和实验研究的执行人；徐忆纯完成数据分析和论文初稿的写作；梁婉琪、王灿华和余婧是项目构思者及负责人，指导实验设计，数据分析和论文的写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家重点研发项目(2016YFD0100902)和国家自然科学基金(31700276)共同资助。

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